《大豆在暗誘導下光周期及衰老相關基因的差異錶達研究》講述瞭:黑龍江省是我國大豆主要生産基地，加入世貿組織後，大豆麵臨嚴重的進口壓力。主要原因是我國大豆單産低，競爭力不強。大豆屬於短日照植物，其生長發育對光周期反應非常敏感，這一特性嚴重阻礙大豆品種的適應性，是製約大豆單産提高和穩産的關鍵因素。暗處理相當於短日照，可以縮短大豆的開花和成熟期，其錶型之一是加速葉片的衰老。葉細胞的結構、代謝和基因錶達都協調的發生變化，細胞器官的組分被依次有序的分解。代謝變化包括閤成代謝活性的減弱，如光閤作用和蛋白質的閤成，以及分解代謝的加速，如核酸降解和蛋白水解。這些對維持植物生長和生殖是非常必要的，基因轉錄物豐度的巨大變化揭示瞭從有光閤活性的葉片到作為流動營養物來源的衰老器官來維持發育的轉變情況。

為瞭打破大豆種植區域的局限性，本研究在細胞分子水平上從基因差異錶達的角度研究短日照光周期誘導開花和衰老過程中基因轉錄豐度的變化，剋隆與大豆光周期反應及衰老有關的基因，從而探索大豆葉片感受日長變化誘導開花和衰老的復雜機製。雖然植物花器官的分化發生在頂端分生組織，在開花過程中的基因錶達也必然在頂端分生組織中有所反映，然而植物感受光的器官是葉片，並利用長距離信號通過韌皮部傳導至頂端分生組織(SAM)影響生殖生長，在光周期控製開花過程中也必然牽涉葉片中很多基因的互作。由於黑暗的長度是開花時間的關鍵決定因素，在光周期控製開花過程中基因可能在夜間錶達有差異，所以，以晝夜交替時的大豆的兩個樣本的葉片為研究目的對象，構建瞭差異錶達的cDNA消減文庫，發現與暗誘導相關的差異錶達基因，揭示瞭有關參與機體暗適應下蛋白質的上調錶達的信息，為進一步分離暗處理産生差異錶達基因奠定瞭基礎。

通過轉化短日照煙草，進行光周期反應基因的功能驗證，分析該類基因在光周期反應中的作用。同時，研究外源激素的施加對光周期途徑相關轉錄因子基因錶達的影響；分析開花誘導中基因組織特性的錶達情況。本研究的宗旨是通過基因的剋隆和改造，試圖從根本上改變大豆對光的敏感性，為大豆高産穩産提高尋找新的突破口，從根本上扭轉我國大豆依賴於進口的被動局麵。

主要結果如下。

1.本試驗首次應用抑製性消減雜交(SSH)技術以東農u3大豆的短日照(8h光/16h暗)和長日照(16h光/8h暗)兩個樣本為研究目的對象，構建瞭含有1738個剋隆的差異錶達的cI)NA消減文庫，對148個剋隆進行測序，在此基礎上發現瞭76個與暗誘導相關的差異錶達ESTs(上調至少3倍)，根據Blastn和Blastx推測這些ESTs的功能包括參與轉錄、信號轉導和細胞凋亡的調節類蛋白；參與大分子降解的酶類如蛋白和核酸的降解、參與細胞壁修飾的閤成代謝、初級代謝以及次級代謝的酶類和解毒與防衛的壓力反應的基因。揭示瞭有關參與機體暗適應下蛋白質的上調錶達的信息，為進一步分離短日處理産生差異錶達基因奠定瞭基礎。

2.為瞭研究GmRAV在大豆短日照信號轉導中的可能作用，我們利用cDNA末端快速擴增(RACE)技術從大豆中剋隆瞭編碼GmRAv的cDNA序列。序列分析結果錶明，GmRAV基因編碼351個氨基酸，含有AP2/ERF和B3結構域，GenBank登陸號為DQ147914，其DNA序列與辣椒、水稻和擬南芥RAV基因高度同源。

3.Real-time RT-PCR分析在短日照和長日照條件下大豆葉片中GmRAV基因mRNA轉錄物的豐度變化，錶明該基因的豐度在短日照(SD)時都要顯著高於在長日照(LD)條件下的豐度。

4.分析GmRAV基因在不同組織中mRNA轉錄物的豐度變化錶明，SD強烈誘導GmRAV基因在葉、根和莖中的錶達。

5.構建瞭植物錶達載體pBI121-GmRAV，用農杆菌介導法轉化煙草過量錶達該基因，獲得卡那黴素抗性植株54株。PCR方法鑒定Tn轉基因株係，獲得18個轉基因的PCR陽性植株。通過Northern分析錶明這4株轉基因煙草中的GmRAV基因都轉錄，錶明它們都已成功轉入煙草中，並正常錶達。

6.GmRAV過量錶達的煙草植株與對照相比無論在長日照和短日照下植株都明顯矮小，節間距短，節數少，並且在土壤中生長時葉片更深綠，葉片小，GmRAV過量錶達對莖和葉的發育以及植株的生長有推遲抑製作用。轉大豆GmRAV基因的煙草植株無論在長日照和短日照條件下均錶現齣開花延遲的特徵，並且光周期敏感性增強，非轉基因煙草在長日照比短日照條件下開花提前3天，而GmRAV過錶達的煙草植株在長日照比短日照條件下開花卻提前13天。

7.GmRAV是BR信號轉導途徑的抑製因子，GmRAV基因通過抑製BR信號而抑製植物細胞伸長從而抑製生長，導緻轉基因植株矮化。

8.GmRAV是GA生長信號轉導途徑中的促進因子，是ABA和黑暗促進衰老途徑中的促進因子。