具体描述
内容提要
本教程的实验是以pUC118质粒为载体克隆一卡那
霉素抗性基因，转化子鉴定用快速抽提酶切法与非放射
性标记探针的菌落原位杂交法。整个实验过程包括质粒
抽提、电泳、酶切、片段回收、连接、转化、快速鉴定、探针
标记、原位吸印、杂交与检测等基因工程的最基础的实验
步骤。除上述系列实验外还有一独立的PCR实验――用
头发进行人的性别鉴定。
本书可作为基因工程实验课程的教材，也可供生物
学科有关各专业教师和科研人员参考。
作者简介
目录信息
绪论
本教程基因工程实验流程图
实验一 碱法抽提质粒DNA
一 实验目的
二 实验原理
（一）克隆载体pUC118质粒与宿主菌MV1184
1pUC118质粒结构
2MV1184宿主菌F＇因子基因型
3MV1184宿主菌染色体基因型
（二）质粒DNA的抽提
1裂解细胞
2分离
3纯化
（三）碱法抽提的主要试剂
（四）抽提产量与试剂用量的估算
1抽提产量估算
2试剂用量估算
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验二 电泳法测定DNA的浓度与纯度
一 实验目的
二 实验原理
（一）琼脂糖凝胶
（二）电泳时DNA迁移的影响因素
1DNA分子质量的影响
2DNA构型的影响
3胶浓度的影响
4电场强度的影响
5溴乙锭的影响
6电泳缓冲液的影响
7碱基组成与电泳温度的影响
（三）电泳缓冲液
1TAE
2TBE
3TPE
（四）上样液
（五）上样量的控制
（六）DNA电泳条带的检测
（七）电泳的分子质量梯度标志
1线状分子质量梯度标志
2超螺旋分子质量梯度标志
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验三 载体与供体DNA的酶切
一 实验目的
二 实验原理
（一）限制性内切酶的一般性质
1一般限制酶的识别位点
2识别超长碱基序列的酶
3各类粘性末端的特点
4同识别序列的酶
5酶切反应中的位点优先现象
6DNA构型对酶切的影响
7近末端切割
8酶的星号反应
9大肠杆菌中甲基化现象对酶切的影响
10能切割单链的限制酶
（二）限制性内切酶的使用
1制作基因图谱
2克隆基因
3制备探针
（三）酶切方式
1部分酶切
2完全酶切
（四）酶的质量鉴定
（五）酶的保存
（六）酶单位的定义
（七）限制酶的作用条件
1作用温度
2缓冲体系
3反应时间
4DNA的纯度与浓度
（八）终止酶反应的方法
（九）酶切失败的原因及处理的方法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验四 目的基因片段的回收
一 实验目的
二 实验原理
（一）各类回收方法
1电泳回收法
2收集孔电泳回收法
3机械破碎凝胶回收法
4溶（熔）胶回收法
5琼脂糖酶降解凝胶回收法
（二）回收方法的选择与操作注意事项
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验五 载体与供体DNA的连接
一 实验目的
二 实验原理
（一）早期的连接理论
（二）近期的计算机模拟反应进程
（三）连接酶
（四）连接反应的影响因素
1连接缓冲液的影响
2pH值的影响
3ATP浓度的影响
4连接温度与时间的影响
5酶浓度的影响
6DNA浓度的影响
7DNA序列的影响
8其他抑制因素的影响
（五）三种连接酶单位定义
1Weiss单位
2d（A―T）环化单位
3粘性末端单位
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验六 CaCl2法转化大肠杆菌
一 实验目的
二 实验原理
（一）各种转化方法与转化率的衡量指标
（二）转化率的影响因素
1试剂（包括水）纯度与器皿清洁程度的影响
2接种前菌种保存方式的影响
3宿主菌生长时期的影响
4CaCl2法0℃放置时间的影响
5化合物与无机离子的影响
6质粒大小、构型与复制起点的影响
7竞争DNA的影响
8共转化质粒的影响
9质粒DNA与转化细胞比例的影响
10菌株基因型recA＋与recA 的影响
11连接缓冲液的影响
（三）大肠杆菌中的限制系统与限制修饰系统
1Mcr限制系统
2Mrr限制系统
3hsd限制修饰系统
（四）宿主菌的选择
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验七 酚/氯仿法快速鉴定转化子
一 实验目的
二 实验原理
（一）DNA水平检测
1快速抽提电泳分析
2快速抽提酶切分析
3原位杂交法
4斑点杂交法
5Southern杂交法
6DNA序列分析
（二）mRNA水平检测
1R环电子显微镜法检测
2杂交抑制翻译
3杂交选择翻译
（三）蛋白质水平检测
1沉淀免疫检测法
2其他免疫检测法
（四）功能水平检测
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验八 随机引物法标记DNA探针
一 实验目的
二 实验原理
（一）酶法标记于链上
1缺口转移法
2随机引物法
3PCR法
（二）酶法标记于末端
13′末端标记法
25＇末端标记法
（三）化学法标记于链上
1直接标记法
2介导标记法
（四）化学法标记于末端
1合成时引入氨基或巯基
2合成后引入氨基或巯基
（五）光化学法标记于链上
1芳香叠氮化合物
2呋喃香豆素衍生物
（六）人工合成于链上
1掺入碱基类似物
2掺入核糖类似物
（七）检测酶直接标记法
1检测酶直接标记于链上
2检测酶直接标记于末端
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验九 菌落原位吸印
一 实验目的
二 实验原理
（一）各类吸印膜
1硝酸纤维素膜（NC膜）
2叠氮氧苄甲基纤维素纸（DBM纸），重氮苯硫醚
纤维素纸（DPT纸）和氨基苯硫醚纤维素纸（APT
纸）
3二乙氨基乙基纤维素纸（DEAE纸）
4ECTELA纸
5尼龙膜
6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
7其他膜
（二）各种转移方法
1毛细管转移法
2真空转移法
3电转移法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十 DNA分子杂交
一 实验目的
二 实验原理
（一）DNA的复性与杂交反应动力学方程式
1双链DNA的复性过程
2单链探针的杂交过程
3双链探针的杂交过程
（二）杂交速率的影响因素
1探针分子复杂性的影响
2探针分子浓度的影响
3杂交温度的影响
4杂交液pH值的影响
5杂交液中离子强度的影响
6杂交液中甲酰胺浓度的影响
7杂交促进剂的影响
（三）杂交反应的两种模式
（四）杂交分子稳定性的影响
1杂交液中Na＋离子浓度的影响
2探针分子中GC％的影响
3杂交液中甲酰胺浓度的影响
4探针分子长度的影响
5与目标DNA错配的影响
6杂交液pH值的影响
（五）杂交的步骤
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十一 显色法检测杂交结果
一 实验目的
二 实验原理
（一）酶法显色原理
1辣根过氧化物酶
2碱性磷酸酯酶
（二）免疫法检测原理
（三）生物素－亲和素法检测原理
（四）其他检测法
1胶体金标记――银加强检测法
2时间分辨荧光检测法
三 试剂与器材
四 实验步骤
实验十二 PCR法鉴定人的性别
一 实验目的
二 实验原理
（一）PCR的引物设计
1引物的长度
2引物的GC％含量
3引物的3′端起始碱基
4引物无回文对称结构
5引物自身不能配对
6两个引物的Tm值
7两个引物之间不能配对
（二）PCR的反应体系
1模板DNA
2引物
三 分光光度计的使用
四 电泳仪的使用
五 微量移液器的使用
六 凝胶摄影
七 酚的重蒸与饱和处理
八 RNA酶的使用与预处理
九 缓冲液作用原理与Tris・Cl的配制
十 菌种与DNA样品的保存
十一 器皿的清洗处理
十二 器皿和试剂的灭菌处理
十三 器皿的硅化处理
十四 大肠杆菌常用基因型
参考文献
· · · · · · (收起)
读后感
评分
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用户评价
这本教材的排版和插图真是太让人眼前一亮了。封面设计简约而不失科技感，内页的布局也十分清晰合理，阅读体验极佳。特别是那些流程图和实验步骤的示意图，绘制得非常精细，几乎不需要额外的文字解释就能让人明白其中的关键环节。我尤其欣赏它在细节上的处理，比如不同实验技术的原理图，不仅准确，而且色彩搭配合理，让人在学习复杂概念时也能感到愉悦。书本的纸张质量也很好，触感温润，长时间翻阅也不会觉得累。感觉作者在设计这本书的视觉呈现上花费了大量的心思，使得原本可能枯燥的实验技术内容变得生动活泼起来，这对于初学者来说无疑是一个巨大的福音，能有效降低阅读的畏难情绪，让人更有动力去探索接下来的内容。
评分从设备和耗材的选择角度来看，这本书的参考价值极高。它不仅描述了实验步骤，还对不同实验平台和试剂的优劣进行了客观的比较和评价。例如，在介绍某个分析检测方法时，书中会对比不同型号的检测仪器的灵敏度和准确性，并给出不同品牌试剂盒的适用范围建议。这种贴近采购和实际运行成本的考量，对于指导实验室建设和项目预算非常有帮助。它不仅仅是一本教学用书，更像是一本兼顾效率、成本与质量的综合技术决策指南。对于经费有限但追求高质量数据的研究者来说，书中提供的这些“软信息”的价值甚至超过了纯粹的“硬操作”。
评分这本书的结构安排显示出作者深厚的教学功底和对学科脉络的精准把握。它并非简单地罗列技术点，而是构建了一个逻辑严密的知识体系。从基础的前处理技术，到核心的分子生物学技术，再到后期的分析与鉴定方法，层层递进，相互关联。更难得的是，它在介绍每一种技术时，都会穿插相关的应用案例，这使得抽象的技术操作有了具象化的意义。比如，在讲解某个分离技术时，会立即引出它在疾病诊断中的实际应用，这种理论与实践的无缝衔接，极大地提升了知识的深度和广度。对于希望构建完整技术知识框架的学习者来说，这本书提供了绝佳的蓝图。
评分我是一名正在准备毕业设计的研究生，手头有许多不同版本的实验指导书，但这本书给我的感觉是最“实用”和“贴近一线操作”的。它没有过多纠缠于晦涩难懂的理论推导，而是将重点放在了“怎么做”和“为什么这么做”上。很多章节对于关键步骤的操作技巧描述得极其到位，比如离心管的盖紧程度、酶的加入顺序、PCR扩增的退火温度优化等，这些都是教科书上往往一笔带过，但在实际操作中决定成败的关键点。读完这部分内容，我感觉自己仿佛站在了操作台前，跟着作者的指导一步步完成实验，这种沉浸式的学习体验，远比单纯记忆公式或步骤来得有效得多。这本书无疑是实验室里不可或缺的“实战手册”。
评分我注意到这本书的语言风格非常严谨且富有逻辑性，但同时又保持着一种恰到好处的学术亲和力，没有那种高高在上的说教感。作者善于使用精确的术语，确保专业性和准确性，但在解释复杂概念时，又能用清晰、简洁的语言进行阐述，避免了不必要的晦涩。对于某些容易混淆的概念，作者会特意设置对比分析或易错点提醒，这种细致入微的关怀，体现了编者对学生学习难点的深刻理解。阅读过程中，我感觉像是在与一位经验丰富、耐心细致的导师进行深入的探讨，总能在关键时刻得到启发和指引，让人感到非常安心和信服。
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