Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 244) pdf epub mobi txt 电子书 下载 2026

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出版者:Humana Press

作者:Cutler, Paul 编

出品人:

页数:496

译者:

出版时间:2003-12-12

价格:USD 139.00

装帧:Hardcover

isbn号码:9781588290670

丛书系列:

图书标签:

• Protein Purification
• Molecular Biology
• Biochemistry
• Protocols
• Laboratory Techniques
• Life Sciences
• Biotechnology
• Chromatography
• Protein Chemistry
• Recombinant Proteins

基因工程与蛋白质工程应用指南：从基因克隆到功能分析 ISBN： 978-1-61779-987-6 出版年份： 2024 页数： 约 700 页 --- 内容概述 本书《基因工程与蛋白质工程应用指南：从基因克隆到功能分析》是一本面向分子生物学、生物化学以及生物技术领域研究人员和高级学生的实用型参考手册。它系统地、深入地阐述了现代分子生物学实验室中核心的基因操作技术，重点关注基因的获取、修饰、表达调控以及随后对目标蛋白质进行功能和结构解析的全流程。 本书旨在提供详尽的实验步骤、必要的理论背景，以及针对常见技术难题的故障排除策略，帮助读者高效地设计和执行复杂的生物学实验。全书内容横跨分子克隆学的基石性技术，延伸至先进的蛋白质工程策略，覆盖了从DNA层面到功能性生物大分子层面的全景图。 第一部分：核心分子克隆技术与基因操作基础 本部分奠定了进行任何蛋白质研究的分子基础，详细介绍了获取和修饰目标基因所需的关键技术。 第一章：核酸的提取、鉴定与定量 本章首先回顾了从不同来源（细菌、酵母、哺乳动物细胞和组织）高效提取高质量基因组DNA、质粒DNA和总RNA的方法。重点讨论了去除PCR抑制剂和RNA酶污染的优化策略。 DNA/RNA的纯化流程： 酚/氯仿萃取、基于硅胶柱的快速提取法的原理与优化。 定量与质量评估： 使用分光光度计（NanoDrop）、荧光定量（Qubit）以及凝胶电泳对核酸纯度（A260/280, A260/230比值）和浓度进行精确判断。 逆转录技术（RT-PCR/RT-qPCR）： 详细阐述了cDNA合成的效率影响因素，以及利用实时荧光定量PCR进行基因表达水平分析的最佳实践。 第二章：PCR及其高级应用 聚合酶链式反应（PCR）是基因操作的基石。本章不仅覆盖了标准PCR的优化，还深入探讨了各种变体在特定研究场景下的应用。 标准PCR优化： 引物设计原则、Tm值计算、DNA聚合酶的选择（如高保真酶、耐热性酶）及其在不同模板上的适用性。 重叠延伸PCR与多片段连接： 用于构建复杂表达载体或基因文库的无缝克隆技术。 定量PCR (qPCR) 深度解析： 标准曲线的建立、内参基因的选择、溶解曲线分析以及绝对/相对定量方法的选择标准。 TA克隆与SDM（定点突变）： 介绍利用Taq酶的A尾特性进行载体构建，以及通过SDM高效引入点突变或小的序列修饰。 第三章：载体构建与序列操作 本章聚焦于将目标基因整合到合适的表达系统中。 限制性内切酶与连接： 传统粘性末端和平末端连接的步骤详解，以及应对酶切效率低下的策略。 现代无缝克隆技术： 详细介绍Gibson Assembly、SLIC（Sequence, Ligation-Independent Cloning）以及Gateway LR反应体系的原理和操作规程，强调其在快速构建多基因载体中的优势。 载体选择指南： 区分原核表达载体（如pET系列、pGEX系列）、真核表达载体（如pCMV、pBabe）和慢病毒/腺病毒载体的关键特征和适用性评估。 第二部分：蛋白质高效表达与调控策略 本部分从基因转入细胞后，探讨如何优化蛋白质的产量和质量。 第四章：原核表达系统优化 本章专注于利用大肠杆菌系统进行目标蛋白的快速、高产出表达。 表达宿主菌株的选择： 讨论BL21、Rosetta、Origami等不同突变株对二硫键形成、稀有密码子翻译的帮助。 诱导策略与时机控制： IPTG浓度滴定、温度梯度诱导（低温低速诱导以减少包涵体形成）、以及利用化学诱导剂（如阿拉伯糖）进行更精细的调控。 共表达策略： 探讨对分子伴侣（如GroEL/GroES）或硫氧还蛋白（Trx）进行共表达，以促进复杂蛋白正确折叠的实验方案。 包涵体的处理与复性： 详细介绍包涵体的分离、溶解（尿素/盐酸胍）步骤，以及透析法、梯度稀释法等主流复性方案的优缺点和操作细节。 第五章：真核细胞与特定系统表达 针对需要翻译后修饰或复杂折叠的蛋白质，本章提供了替代方案。 哺乳动物细胞表达： 瞬时转染（Lipofectamine, PEI）与稳定细胞株的建立流程，以及如何评估转染效率和蛋白质分泌水平。 酵母（Pichia/Saccharomyces）表达： 适用于糖基化和分泌型蛋白，介绍AOX1启动子的调控和筛选策略。 昆虫细胞/杆状病毒系统： 用于大规模生产具有复杂翻译后修饰的蛋白，强调多角体蛋白（Polyhedrin）启动子的强力驱动作用。 第三部分：蛋白质功能性分析与结构解析准备 在成功表达目标蛋白质后，本部分侧重于如何验证其纯度和活性，并为后续结构生物学研究做准备。 第六章：蛋白质的检测、分离与初步鉴定 本章提供了一套完整的质量控制和初步表征流程。 SDS-PAGE与Western Blotting： 考马斯亮蓝染色与银染的敏感度比较，以及免疫印迹（Western Blot）中一抗/二抗的优化、封闭条件和信号增强技术。 蛋白质的初步稳定性评估： 利用紫外吸收光谱（280nm）和氨基酸分析（AAA）确定实际蛋白质浓度。 等电点聚焦（IEF）与双向电泳（2D-PAGE）： 用于分析蛋白质的电荷异质性。 第七章：亲和标签的移除与纯化策略的衔接 详细讨论了如何利用常见的标签（His, GST, MBP, FLAG）进行初级纯化，以及后续去除标签的重要性。 标签酶的筛选与切割条件： 讨论凝血酶、因子Xa等酶在不同缓冲液中的活性和特异性。 多步层析的策略设计： 阐述离子交换层析（IEX）和疏水作用层析（HIC）如何作为第二、三步纯化，以最大化去除宿主细胞蛋白（HCPs）和其他杂质。 尺寸排阻层析（SEC）： 作为最终精纯步骤，用于确定蛋白质的分子量、寡聚状态和聚集情况。 第八章：蛋白质活性测定与稳定性评估 本章关注于量化蛋白质的生物学功能。 酶活性的定量分析： 底物选择、动力学参数（Km, Vmax）的测定方法，以及如何设置合理的反应体系以避免酶失活。 结合实验的设计： 包括表面等离子共振（SPR）和生物层干涉（BLI）技术在分子间相互作用力（KD值）测定中的应用原理和数据解读。 稳定性研究： 利用差示扫描荧光法（DSF）或动态光散射（DLS）评估蛋白质的热稳定性和聚集倾向，为长期储存和后续晶体培养提供参考依据。 --- 目标读者 本书适合于： 1. 分子生物学、生物化学及生物工程专业的研究生和博士后。 2. 工业界从事生物制药、酶工程和诊断试剂开发的研发人员。 3. 需要构建和验证重组蛋白系统的生物技术实验室技术人员。 通过学习本书，读者将能够独立、高效地规划和执行从基因克隆到高纯度、活性蛋白质制备的完整实验流程，为后续的结构生物学、药物筛选和机制研究打下坚实的基础。

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