PCR技术实验指南 pdf epub mobi txt 电子书 下载 2026

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出版者:科学出版社

作者:黄培堂

出品人:

页数:550

译者:

出版时间:2005-3

价格:98.00元

装帧:

isbn号码:9787030065452

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• 科学
• 生物
• PCR
• 分子生物学
• 实验技术
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• 医学
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• 指南

《分子生物学实验技术精要》 前言 分子生物学是现代生命科学的核心领域，它以前所未有的深度揭示了生命活动的奥秘，并催生了一系列革命性的技术革新。从基因的结构与功能解析，到疾病的诊断与治疗，再到生物技术的产业化应用，分子生物学的影响无处不在。《分子生物学实验技术精要》旨在为初学者和有经验的研究人员提供一套系统、实用且易于掌握的分子生物学实验操作指南。本书聚焦于基础且至关重要的实验技术，力求在繁杂的实验步骤中提炼出核心要点，帮助读者快速上手，独立完成实验，并理解实验结果背后的生物学意义。 本书内容涵盖了分子生物学研究中最常用、最核心的技术方法。我们深知，理论的学习离不开实践的检验，而扎实的实验功底是科研创新的基石。因此，本书力求在理论讲解与实践操作之间取得平衡，每一项技术都配以清晰的操作流程、详细的注意事项以及常见的故障排除建议。我们希望通过本书，能够激发读者对分子生物学实验的兴趣，培养严谨细致的科研态度，并为他们在各自的研究领域打下坚实的基础。 第一章 核酸的提取与纯化 核酸（DNA和RNA）是生命遗传信息的载体，其提取与纯化是所有分子生物学实验的首要步骤。本章将详细介绍不同来源（如血液、组织、细胞、植物材料等）的DNA和RNA的提取方法，包括但不限于： 基因组DNA的提取： 细胞裂解与蛋白酶K消化： 介绍不同裂解液的成分与作用，以及蛋白酶K在去除蛋白质中的关键作用。 酚-氯仿抽提法： 详细阐述有机溶剂（酚、氯仿）在分离DNA与蛋白质、脂质等杂质中的原理与操作要点。 硅胶膜吸附法： 讲解不同商用试剂盒基于硅胶膜吸附原理的DNA提取流程，强调洗脱缓冲液的选择与操作。 无机盐沉淀法： 介绍利用高浓度无机盐（如醋酸钠、乙醇）沉淀DNA的原理和操作步骤。 总RNA的提取： 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿（Trizol）法： 详细介绍该经典方法的原理、步骤以及对RNA完整性的保护机制。 柱式纯化法（基于Trizol或直接裂解）： 讲解利用RNA结合柱进行纯化的原理，以及试剂盒中不同缓冲液的作用。 组织RNA的提取特异性： 针对组织样本，讨论研磨方式、酶解条件等优化。 RNA的质量与浓度检测： 介绍使用分光光度计（如NanoDrop）和琼脂糖凝胶电泳评估RNA的OD260/280比值、OD260/230比值以及28S/18S rRNA比例，以判断RNA的纯度和完整性。 第二章 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常用技术。本章将深入讲解： 电泳原理： DNA带负电荷，在电场中向正极移动，其迁移速率受分子大小、凝胶浓度、离子强度等因素影响。 凝胶配制： 详细介绍不同浓度琼脂糖凝胶的配制方法，以及根据DNA片段大小选择合适凝胶浓度的原则。 样品处理： DNA样品与上样缓冲液（含染料和甘油）的混合，以及上样孔的选择。 电泳条件设置： 电压、电流、电泳时间的选择，以及电泳缓冲液（如TAE、TBE）的作用。 DNA染色与成像： 介绍EB（溴化乙锭）等DNA染料的使用方法、注意事项（如安全防护），以及紫外透射仪或凝胶成像系统上的DNA条带观察。 DNA分子量标准品的使用： 如何利用DNA Marker（Ladder）来估算样品DNA片段的大小。 常见问题分析： 如条带弥散、拖尾、无条带等现象的可能原因及解决办法。 第三章 蛋白质的提取与定量 蛋白质是生命活动的主要执行者，其提取和定量是研究蛋白质功能、表达和相互作用的基础。本章将涵盖： 细胞和组织总蛋白的提取： 裂解缓冲液的设计： 介绍不同组成成分（如去垢剂、盐、还原剂、蛋白酶抑制剂）的作用，以及针对不同细胞类型（如真核细胞、原核细胞、细菌、酵母）的优化。 超声破碎、研磨、匀浆等物理方法： 探讨不同的破碎方式对蛋白质提取效率的影响。 膜蛋白的提取： 介绍使用更强的去垢剂和特殊的提取条件。 蛋白质的定量方法： Bradford法： 讲解其原理（考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的显色反应），操作流程，以及干扰因素（如去垢剂）。 BCA法： 介绍其原理（铜离子与BCA试剂的显色反应），灵敏度高，受去垢剂干扰较小。 Lowry法： 经典方法，原理复杂，但仍有应用场景。 分光光度法（OD280）： 适用于含有色氨酸、酪氨酸的蛋白质，但准确性受污染影响较大。 标准曲线的绘制与应用： 强调使用已知浓度的BSA（牛血清白蛋白）等作为标准品。 第四章 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） SDS-PAGE是分离、检测和初步纯化蛋白质的标准技术。本章将详细讲解： SDS-PAGE原理： SDS的作用： 负电荷干扰，使蛋白质根据分子量分离。 聚丙烯酰胺凝胶的作用： 作为分离介质，具有可调的孔径。 电泳条件： 恒压或恒流电泳。 凝胶制备： 浓缩胶与分离胶： 讲解两种凝胶的配制浓度差异及其功能。 梳子的选择： 影响孔板的密度。 样品制备： 变性与还原： SDS（十二烷基磺酸钠）的去折叠作用，β-巰基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）的还原二硫键作用。 上样缓冲液： glycerol、染料（如溴酚蓝）等成分。 电泳过程： 电泳槽的组装与缓冲液： 介绍SDS-PAGE电泳缓冲液的组成。 电泳参数设置： 电压、电流、时间。 蛋白质染色： 考马斯亮蓝染色： 经典、经济的染色方法。 银染： 高灵敏度染色，适用于检测低丰度蛋白质。 西斯汀染色： 用于检测含巯基的蛋白质。 蛋白分子量标准品： 如何利用蛋白Marker估算未知蛋白的大小。 胶体蛋白的回收： 简要介绍从SDS-PAGE胶中回收目的蛋白的方法。 第五章 Western Blot（蛋白质印迹） Western Blot是一种检测特定蛋白质是否存在及其相对含量的敏感技术，是分子生物学研究中应用最广泛的技术之一。本章将详细阐述： Western Blot基本原理： SDS-PAGE分离蛋白质后，通过电转印将蛋白质转移到固相载体（如PVDF膜或NC膜）上，然后利用特异性抗体进行检测。 电转印（Transfer）： 湿转、半干转、干转： 介绍不同转印方式的优缺点。 转印缓冲液： Methanol（甲醇）在增强疏水性膜结合中的作用。 转印条件优化： 电压、电流、时间、温度。 转印效率检测： ponceau S染色或其他方法。 封闭（Blocking）： 封闭液的选择： 脱脂奶粉、BSA（牛血清白蛋白）。 封闭目的： 避免抗体非特异性结合。 一抗孵育： 一抗的选择： 针对目的蛋白的特异性抗体，关注特异性、灵敏度和批次稳定性。 稀释度与孵育时间/温度： 优化实验条件。 二抗孵育： 二抗的选择： 标记有酶（如HRP、AP）或荧光分子的抗体，能与一抗的种属相匹配。 洗涤： 充分洗涤去除未结合的二抗，降低背景。 显色与信号检测： 底物（Substrate）的选择： 如ECL（增强化学发光）底物，与HRP偶联的二抗反应产生光信号。 信号成像： 胶片曝光、化学发光成像仪。 结果分析： 条带的出现与位置： 判断目的蛋白的存在与分子量。 条带的灰度值： 相对定量目的蛋白的表达水平。 内参蛋白（Loading Control）： 如Actin、GAPDH，用于校正上样量差异。 常见问题及排除： 高背景、无信号、条带模糊等。 第六章 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA是一种用于检测和定量溶液中抗原或抗体浓度的免疫学方法。本章将介绍： ELISA基本原理： 利用抗原-抗体特异性结合，结合酶催化显色反应，通过检测显色深浅来定量目标物。 ELISA的几种类型： 间接ELISA： 检测抗体。 夹心ELISA： 检测抗原（最常用）。 竞争ELISA： 检测抗原或抗体。 关键步骤： 包被（Coating）： 将抗原或抗体固定在微孔板上。 封闭（Blocking）： 防止非特异性结合。 一抗/抗原孵育： 结合目标物。 酶标二抗孵育： 标记有酶的二抗，识别一抗或抗原。 洗涤： 去除未结合的试剂。 底物孵育与显色： 显色反应。 终止反应： 加入终止液。 结果读取： 使用酶标仪（Microplate Reader）检测吸光度。 结果计算与分析： 标准曲线的绘制，样品浓度的测定。 ELISA的优势与局限性。 第七章 细胞培养基础 无菌细胞培养是研究细胞生物学、信号传导、药物筛选等领域的重要平台。本章将概述： 细胞培养的基本原则： 无菌操作、适宜的培养环境（温度、湿度、CO2浓度）、营养支持。 细胞培养基： 基础培养基： DMEM、RPMI-1640等。 添加物： 血清（FBS）、抗生素（青霉素/链霉素）、谷氨酰胺、生长因子等。 无菌操作技术： 超净工作台的使用。 试剂和器械的灭菌。 移液和倾倒的操作。 细胞传代（Passaging/Subculturing）： 贴壁细胞的消化： 胰酶（Trypsin）的作用。 悬浮细胞的分离。 细胞计数与密度调节。 细胞冻存与复苏： 冻存液的配制： DMSO（二甲基亚砜）的作用。 冻存和复苏过程的注意事项。 细胞株的鉴定与污染检测。 第八章 细胞凋亡检测方法 细胞凋亡（Apoptosis）是程序性细胞死亡，在维持机体稳态中起着重要作用。本章将介绍几种常用的凋亡检测技术： Annexin V-FITC/PI双染法： 原理： 早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）暴露，Annexin V与之结合；晚期凋亡或坏死细胞细胞膜通透性增加，PI可进入细胞核着色。 操作流程： 细胞收集、染色、流式细胞仪检测。 TUNEL染色法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记）： 原理： 检测DNA断裂，是凋亡细胞DNA碎片化的标志。 操作流程： 细胞固定、透化、TUNEL酶促反应、DAPI复染、荧光显微镜观察。 Caspase活性检测试剂盒： 原理： 检测关键凋亡执行酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等的活性。 方法： 比色法或荧光法。 第九章 PCR及其衍生的技术简介 聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增特定DNA片段的强大技术。本章将对PCR及其一些重要的衍生技术进行简要介绍，为后续更深入的学习打下基础。 PCR基本原理： DNA聚合酶、引物、dNTP、模板DNA，通过变性、退火、延伸三个步骤进行指数级扩增。 PCR的组分与优化： DNA聚合酶： 如Taq酶的性质。 引物设计： 长度、Tm值、特异性。 退火温度的优化。 Mg2+浓度对反应的影响。 PCR产物的检测： 琼脂糖凝胶电泳。 qPCR（实时定量PCR）： 原理： 在PCR过程中，利用荧光信号实时监测DNA的扩增量。 荧光染料法（SYBR Green）与荧光标记探针法。 Ct值（循环阈值）与定量分析。 RT-PCR（逆转录PCR）： 原理： 将RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，用于检测RNA的表达水平。 逆转录酶与RNA模板。 附录 常用缓冲液配制方法（如PBS、Tris-HCl、HEPES等） 常用试剂的性质与储存 安全操作规程 结语 分子生物学实验技术是探索生命奥秘的利器。掌握这些基本技术，将为读者打开通往更广阔科研领域的大门。《分子生物学实验技术精要》是我们团队心血的结晶，我们希望本书能够成为您在实验室中值得信赖的伙伴，陪伴您克服实验中的挑战，发现生命的精彩。每一次成功的实验，都离不开精湛的技术和严谨的态度，愿本书能助您在这条探索之路上稳步前行。

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这本书的语言风格是极其严谨且信息密度极高的，它避免了任何不必要的修饰和煽情，直接切入核心科学问题的讨论，这对于追求效率的专业人士而言，无疑是一种福音。在介绍每一个实验步骤时，作者都精确地给出了操作的“窗口”范围和“禁区”范围，例如在酶切或退火温度的选择上，数字的精确性体现了其科研背景的扎实。我发现它有一个很独特的习惯，就是在关键的公式或计算部分，都会附带一个简短的“注释”，解释这个计算在实际应用中会带来什么后果，比如稀释倍数的计算误差如何影响后续的Ct值差异。这使得这本书不仅仅是一本“How-to”手册，更是一本关于“Why-it-matters”的深度解读。阅读过程中，我常常需要频繁地在不同章节间跳转核对，但由于索引和目录设计得极其详尽，定位信息的速度非常快，这在分秒必争的实验准备阶段，极大地节省了时间。可以说，这本书的每一句话似乎都经过了反复的推敲，旨在用最少的文字传达最充分的信息量。

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我得说，这本书的章节逻辑组织得非常巧妙，它并没有采取那种生硬的、堆砌知识点的叙述方式。相反，它更像是一位经验丰富的老教授，循序渐进地引导你进入分子生物学实验的核心领域。开篇部分对于PCR原理的阐述，并没有止步于教科书式的定义，而是深入挖掘了不同热循环程序设计背后的酶动力学考量，这一点对于理解“为什么”至关重要。接着，作者非常务实地引入了各种PCR变体的应用场景，比如定量PCR（qPCR）和反转录PCR（RT-PCR），并且在介绍每种技术时，都配有详细的流程图和关键参数的优化建议。特别是关于引物设计的章节，它不仅仅罗列了规则，还通过大量的实际案例对比了合理引物和设计不当引物所导致的结果差异，这种“错误示范”的教学方法，远比单纯的理论灌输来得深刻和直观。我尤其欣赏它在故障排除部分所花费的篇幅，那些常见的带污染、扩增失败、非特异性条带等问题，都被详细地分解成了前置处理、反应体系和循环条件三个维度来分析，实用性极强，感觉像是把多年积累的“实验室经验”直接浓缩在了纸上。

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这本书的一个显著特点是它对当前分子生物学领域最新进展的收录和整合，显示出编者团队具有持续的关注度和前瞻性。虽然基础原理恒久不变，但实验技术的更新迭代速度极快，而这本书显然没有停留在过时的技术点上。例如，在核酸提取的部分，它详细对比了基于硅胶柱的方法和基于磁珠的方法的优劣，并特别强调了自动化设备在处理大规模样本时的优势和局限性。更让我惊喜的是，书中竟然专门开辟了一个章节，讨论了基于第三代测序技术（如PacBio和Oxford Nanopore）的文库构建与PCR的衔接问题，虽然只是作为前沿展望，但这无疑拓宽了读者对未来实验方向的视野。对于希望将实验室工作与产业前沿接轨的读者来说，这种对新技术的积极拥抱，使得这本书的生命力大大延长。它成功地在扎实的基础教学和对未来趋势的把握之间找到了一个动态的平衡点，让人感觉手中捧着的不仅仅是一本教材，而是一份与时俱进的实验伙伴。

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这本书的图文结合达到了一个近乎完美的平衡点，尤其是在涉及复杂仪器操作和电泳结果判读的部分。作者似乎深知，对于实验操作而言，文字描述的局限性。因此，大量的示意图被精心绘制，这些图示并非简单的流程框线图，而是采用了三维透视图来模拟真实的实验环境，比如凝胶电泳槽的装配、移液器的正确握持姿势，乃至微孔板的布局设计。这些细节的捕捉，对于初学者来说简直是救命稻草，极大地减少了初次上手的摸索时间。更不用说，那些关于DNA条带的解释部分，几乎囊括了所有可能的异常情况，并清晰地标注了其可能的原因。此外，书中还穿插了一些高分辨率的扫描电镜照片，展示了DNA聚合酶在模板上的工作状态，这种将微观机制与宏观实验操作相结合的方式，极大地提升了读者的理论认知深度。相较于一些仅有文字和简单线条图的参考书，这本书在视觉传达上的投入，无疑使其在指导实际操作层面更具说服力和易用性。

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这本书的装帧设计实在是一流，封面采用了一种哑光处理的硬壳纸，触感温润而不失质感，深邃的靛蓝色背景上，烫金的标题“PCR技术实验指南”在光线下闪烁着低调而专业的微光。内页的纸张选择也非常考究，偏向米白色的纸张减少了长时间阅读带来的视觉疲劳，而且纸张的厚度适中，即便是高亮标记也不会轻易洇墨。侧边裁切得极为整齐，书脊的装订牢固，即便是频繁翻阅，也能保证书本的完好。整体来看，这本书给我的第一印象是“匠心”二字，它不仅仅是一本工具书，更像是一件值得收藏的工艺品。对于需要经常在实验室中查阅资料的科研人员或学生来说，这样的物理形态本身就是一种阅读的享受和投入的保障。作者在排版上也下了不少功夫，清晰的章节划分、合理的留白，以及那些图表的排布，都体现了对阅读流畅性的高度重视。初次拿到手时，我甚至有些舍不得在上面做标记，但最终还是决定，如此优秀的载体，理应被充分利用起来，毕竟实验的成功与否，最终还是要依赖于其中内容的深度和实用性。这本教材的物理品质，无疑为接下来的学习旅程定下了一个高标准的基础。

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